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DNA自动测序技术

发布时间:2016-05-17 点击:
DNA自动测序技术是以4种荧光染料基团分别作为4种ddNTP终止链的标记物,于20世纪80年代末期建立的一种高效、快速、自动化的序列测定技术。4种荧光染料分别作为测序反应中4种ddNTP终止链的标记物,即4种被双脱氧核苷酸终止的DNA片段分别带上4种不同的颜色。这些DNA片段的混合物同时加在一个样品槽中电泳展开,相互间仅差1个碱基的DNA片段形成一条具有4种颜色的阶梯分布图像。阶梯中的每- DNA片段由标记在该片段上的特征性荧光基团发出的荧光所指示。
  
荧光染料基团作为标记物的基本要求是经过激光诱发的吸收光谱波长在可见光波长范围内,不影响延伸反应,不影响标记后DNA片段的电泳性质。其次要求4种荧光的吸收和激发光波长要有足够的差异,便于检测。荧光染料的掺入的方式有两种:一种是将荧光染料预先标记在测序反应通用引物的5’端。4种荧光标记形成4种标记引物,测序反应分4个反应管进行,特定的荧光染料与相应的ddNTP是对应关系,例如荧光示踪染料JOE标记的通用引物总是与ddATP加在同一个反应管内,因此由ddATP终止的所有延伸链都带有JOE。这种方式被称为Dye-Primers。另一种是将荧光染料基团连在ddNTP上,4种荧光染料分别与4种ddNTP底物连接,反应产生的4组DNA片段分别由特定ddNTP所终止,并且标记有4种不同的荧光发色基团,A、C、G和T分别携带有绿、红、蓝、黄4种荧光。这种方式被称为Dye-Terminators。两种方式各有特点,不过前者要求A,G,C,T分4个反应进行,而后者的4组反应可以在同一管中完成。上述两种方法都能确定4种荧光与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的对应关系,这是后来从电泳中检测标记物信号以及最终读序的基础。
    
自动测序仪器无论是变性PAG平板凝胶电泳还是毛细管电泳,都配置有激光束激发系统和荧光信号收集检测系统。当DNA片段电泳通过检测窗口时,在激光束的激发下,片段的电泳时间和被激发荧光的波长、强度等信号都被记录,由计算机自动作数据处理,最后在屏幕上显示每一样品的各终止片段电泳分离的模拟图像。不同颜色的峰标示各自标记的碱基及其排列顺序(如图所示)。