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聚合酶链式反应--复合PCR

发布时间:2016-05-17 点击:
PCR反应可以做到在反应混合物中加人多对引物同时扩增多个区域(Edwards及Gibbs,1994)。同时扩增两个或更多的DNA区域通常称为多重或复合PCR(如图)。在复合反应中,引物对需要互相匹配。换句话说,引物的退火温度要相似,要避免形成额外的互补区域,避免形成引物二聚体。在复合反应中每增加一对引物会增加引物相互作用的复杂性( Bulter et a1.,2001)。
复合PCR是指在一个反应混合物中使用两对或更多对引物。(a):图中箭头表示三套引物,扩增一条DNA模板上的三个不同基因座。(b):图示经设计的引物,基因座A、B、C的产物片段大小不同,因此可使用依靠片段大小的分离系统进行分析
 
每一个PCR应用都需要在反应成分或温度循环条件上进行某种程度的优化。复合PCR也不例外。实际上,优化复合PCR较单引物PCR更具挑战性,要求同时发生退火的多对引物不能相互干扰。我们需要广泛的优化实验,在被扩增的多个基因座间建立平衡( Kimpton et al.,1996; Markoulatos et al.,2002).
 
当试图获得优化的复合PCR扩增时,要检测有关变化,包括表2中所列试剂及温度循环策略。复合PCR对引物序列、浓度和相关的镁离子浓度通常要求更为苛刻。要增加延伸温度循环的时间,以便使聚合酶充分地复制所有目标DNA。复合扩增有时需要重新设计引物和繁琐的调整引物浓度才能成功获得平衡的PCR产物。
 
DNA遗传标记短串联重复序列(STR)的引物设计将在第五章讨论。STR引物需要调整以达到同一荧光染料标记的基因座目标片段均能分离的效果。而且,引物需充分扩增,基因座间峰高均衡,进行特异性扩增而没有干扰分型的非特异性产物。最后,PCR产物还要“+A”。