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聚合酶链式反应过程之热启动PCR

发布时间:2016-05-17 点击:
常规的DNA聚合酶在低于它们最佳温度的条件下会有一定的活性,Taq酶的最佳温度是七十二度。PCR反应在室温下即发生引物与模板DNA非特异性退火,产生非特异性产物。引物在低温下还有可能形成引物二聚体。一个特别的问题是,这种二聚体比PCR产物短,会得到优先扩增。
    
一旦发生低温非特异引物结合,非目标产物就会在以后的PCR循环中被大量扩增。由于聚合酶忙于扩增这些非特异性产物,目标DNA区域的扩增效果不佳。如果发生这种情况,得到的目标产物会很少,不足以进行其他实验。
 
能在起始阶段提高温度解决低温错配的PCR,称为“热启动”PCR。热启动PCR在样本温度高于预期退火温度(例如六十度)后再加入重要的反应成分,如聚合酶。在反应起始时不加入聚合酶,减少了引物错配和错误延伸。然而,这种方法很繁琐,处理大量样本时耗时长。实际上,这个方法更为不利的地方是,在热循环过程中打开样本管,增加了样本交叉污染的机会。随后将会讨论一种热激活Taq DNA聚合酶,它可使热启动PCR在封闭管中完成。这种酶是AmpliTaq Gold,特别适用于保证PCR扩增的特异性。