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复合PCR优化

发布时间:2016-05-17 点击:
获得具有均衡性的相似产率的PCR反应是个具有挑战性的任务。对于广泛应用的商业试剂盒,单个法医实验室不会对PCR再进行优化实验。而且,内部有效性研究着重于试剂盒手册内提供的不同条件复合扩增优化参数。如对PCR产物的STR峰高,商业试剂盒要评估最佳退火温度(如59℃)和比其高2℃、4℃和降低温度(如55、57、61、630C)的效果。应注意试剂盒提供的手册中与最佳退火温度相关的差异。
 
有效的复合PCR反应的发展需要仔细设计、大量实验、成功的引物设计和反应成分的均衡( Shubei et a1.,1995;Henegariu et a1.,1997;Maukoulatos et al.,2000)。在研发最后程序
时,实验包括退火和延伸温度在内的一系列循环参数。引物浓度是决定整体每一基因座复合PCR反应产率的一个最大的因素(Schoske et al.,2003)。重复实验和引物滴定常用于获得最佳平衡。与单引物反应相比氯化镁和dNTP的浓度略有增加。对复合反应的完整评估还包括增加和除去引物对,观察是否影响其他目标片段的扩增平衡。
    
复合扩增得到25个PCR产物,同时检测包含在这25个扩增产物中的35个Y染色体单核苷酸多态性遗传标记已经可行,这是目前最令人印象深刻的复合PCR( Sanchez et al.,2003)。使用五种荧光染色检测系统能发展复合PCR,可分析超过20个STR基因座(Butleret al.,2002: Hanson及Ballantyne ,2004).